摘要：采用砂基培養法，研究硒對鉛、汞脅迫下大豆生長的影響。對大豆幼苗的株高、結瘤率、植株根系所在沙質培養基pH、葉片干重、葉綠素、葉片丙二醛含量、葉片脯氨酸（Pro）含量、葉片光合效率植株葉片相對電導率以及保護酶POD活性的影響。結果表明，鉛、汞脅迫下大豆植株矮化，重金屬毒害使葉片失綠，干重降低，葉片 MDA 含量增加，POD 活性增強，硒可減輕鉛和汞對于大豆的毒害，表現為: 
本試驗以大豆為材料, 通過砂基培養, 旨在探討硒對鉛和汞脅迫下大豆生長和生理特性的影響, 以探討硒能否抑制或緩解鉛和汞對大豆的毒害。
關鍵詞：硒 重金屬 脅迫 生長影響
英文摘要：
英文關鍵詞：selenium, heavy metal pollution, stress, soybean
 
1.前言：
大豆起源于中G，在中G栽培并用作食物及藥物已有5000年的歷史。大豆呈橢球形、球形，顏色有黃色、淡綠色、黑色等，故又有黃豆、青豆、黑豆之稱。大豆營養豐富，含多種營養成分和生物活性成分，大豆含蛋白質約40%、脂肪20%、碳水化合物20%、粗纖維5%，并含多種礦物質和纖維素，營養價值很高。近些年來，人們發現大豆中有多種具有保健功能的成分，如大豆多肽，大豆低聚糖，大豆膳食纖維及大豆磷脂等，這些成分具有延年益壽、延緩衰老、降血壓、降血脂、抗癌等功能。目前，已從傳統的豆制品（豆腐、腐乳、豆漿）生產到工業化的豆制品生產，如大豆油，豆奶，大豆組織蛋白及大豆異黃酮，大豆卵磷脂等大豆保健品。
硒是廣泛存在于自然界中的一種元素，它是人體內不可缺少的微量元素，缺硒是人體克山病、大骨節病的主要原因，會導致人及動物免疫功能下降，加重心腦血管病、糖尿病、癌癥、克山病和鎘中毒。^[1] 重金屬污染是當今極受人們重視的環境污染問題之一。^[2] 鉛(Pb)在環境中普遍存在，隨著都市化、現代化進程的加快,鉛已經成為我們生活中**常見的化學污染物。鉛的多親和性和蓄積性使得它進入人體后可引起人體許多器官的功能紊亂,包括神經、造血、消化系統及腎臟,同時還損害人體的免疫系統,使機體抵抗力下降。^[3] 汞(Hg)是一種廣泛分布于環境中的劇毒重金屬，^[4] 是一種高毒性重金屬元素,但是由于其特殊的物理化學性質,在工業上又有著多種重要用途而被大量生產和使用,給環境帶來了嚴重的影響。汞在環境中主要以單質汞(Hg)、無機汞(Hg⁺、Hg⁺²鹽及其配合物)和有機汞(烷基汞、苯基汞)的形態存在。各種形態在自然環境中可以發生多種生物轉化和化學轉化,并通過食物鏈富集,對人類和動物造成極大的危害。^[5]而近些年的研究發現，硒具有促進植物新陳代謝和植物對環境脅迫的抗性，并具有拮抗重金屬的作用，^[6]人們發現硒有拮抗鉛毒性的作用:一方面硒是體內抗氧化系統的重要組成成分,能明顯改善鉛中毒誘發的脂質過氧化反應,減輕鉛的危害;另一方面硒與金屬有很強的親和力,可在體內與鉛結合形成金屬硒蛋白復合物,從而可降低鉛的毒性作用。^[3] 隨著工農業的發展，我G土壤環境質量發生了極大變化,土壤污染日益嚴重,目前我G受鎘、砷、鉻、鉛等重金屬污染的耕地面積近2000萬hm²,約占總耕地面積的20 %，除耕地污染外,我G的工礦區、城市也存在土壤(或土地)污染問題。因此,結合目前開展的全G**土壤污染普查以及G外**新研究成果,制定有效的土壤環境標準體系,對于預防和治理土壤污染,改善土壤質量尤為重要。
在現行《食用農產品產地環境質量評價標準》中，土壤中的總鉛定為≤80mg/kg，土壤中汞定為1.0mg/kg(pH＞7.5).近年來 ,美G、英G、澳大利亞等G在研究鉛在土壤中的允許含量時，不采用通常的以食物鉛的衛生標準作為依據，而是以鉛對兒童的毒害、劑量 ——效應關系及血鉛與土鉛的關系作為制定土壤環境標準的基礎。研究表明 ,當土壤鉛含量大于100mg/kg 時 ,兒童血鉛含量則大于15μg/100mL,這對兒健康產生了不良的影響，因此我G環境土壤標準中制定的鉛臨界值遠遠偏高 ,難以保障兒童的健康發展。重金屬通過食物鏈進入人體。對重金屬毒害shou當其沖的是植物。研究表明，適量的硒添加可以緩解重金屬對植物的毒害，所以研究硒對鉛、汞脅迫下大豆的生長影響是很有必要的。本實驗通過測定在硒元素作用下，大豆在重金屬鉛、汞脅迫下其結瘤率、株高、葉片干重（鮮重）、葉綠素含量、脯氨酸含量、葉片丙二醛含量、光合效率以及過氧化物酶（POD）活性的變化，探究硒元素對鉛、汞脅迫下大豆生長的影響。從而探討重金屬與植物的逆境生理關系。
2.材料與方法
2.1實驗材料及處理
   本實驗采用大豆為研究對象。選取飽滿種子消毒，25℃浸種24h催芽2天，移栽于處理過的粗砂培養基內，分為空白組、A組、B組、C組及H組，各組處理見表1
表1 實驗各組處理

用Hoagland培養液每2天澆灌一次，每次5mL.每2天滴加重金屬鉛和汞，各5mL.
2.2營養液及處理液的配制
表2 Hoagland營養液系列成分（1000mL）

	藥品	劑量	配制量（mL）	貯存液	用量（mL）
大量元素	KNO3#p#分頁標題#e#	0.607g/L	1000	20倍	50
	NH4H2PO4	0.115 g/L	1000	20倍	50
	MgSO4·7H2O	0.493 g/L	1000	20倍	50
	Ca(N03)2·4H2O	0.945 g/L	1000	20倍	50
微量元素	H3BO3	2.86 mg/L	1000	1000倍	1
	MnCl2·4H2O	2.13 mg/L
	ZnSO4·7H2O	0.22 mg/L
	(NH4)6Mo7O24·4H2O	0.02 mg/L
	CuSO4·5H2O	0.08 mg/L
半微量元素	Fe-EDTA	6.51mg/L	500	500倍	1

2.3主要儀器及試劑
2.3.1主要儀器
智能光照培養箱（SPX-GB型，上海躍進醫療器械有限公司）
電子天平（AL204型，梅特勒-托利多儀器有限公司）
分光光度計（722型，上海光譜儀器有限公司）
高速離心機（TGL-20B C型，上海安亭科學儀器廠）
電熱恒溫水浴鍋（DK-S24型，上海森信實驗儀器有限公司）
電導率儀（DDS-307A型，上海精密科學儀器有限公司）
智能光照培養箱（SPX-GB型，上海躍進醫療器械有限公司）
電子天平（AL204型，梅特勒-托利多儀器有限公司）
分光光度計（722型，上海光譜儀器有限公司）
高速離心機（TGL-20B C型，上海安亭科學儀器廠）
電熱恒溫水浴鍋（DK-S24型，上海森信實驗儀器有限公司）
電導率儀（DDS-307A型，上海精密科學儀器有限公司）
ph計（PHS-3D型，雷磁）
2.3.2主要試劑
30%過氧化氫、80%乙醇、丙酮、茚三酮試劑、人造沸石、石英砂、碳酸鈣、冰醋酸、三氯乙酸、標準脯氨酸溶液、硫代巴比妥酸（TBA）溶液（用10%TCA配制0.6%的TBA溶液）。
2.4 實驗方法
2.4.1實驗植物大豆的植株苗長
 
2.4.2實驗植物大豆的根冠比
 
2.4.3實驗植物大豆植株葉片丙二醛含量
稱取大豆葉1.0g，加入10%TCA2mL和少量石英砂研磨成勻漿后，進一步加入10%TCA8mL于研缽中充分研磨，勻漿液移入5mL的離心管中，一4000r/min離心10min，收集上清液2mL再加入0.6%TBA混勻在試管上加蓋置于沸水浴中煮沸15min，迅速冷卻離心。以2mL水為空白對照，取上清液測，采用硫代巴比妥酸法測定在450nm、532nm和600nm下的OD值。計算公式如下：
C(μmol/L)=6.45（A₅₃₂-A₆₀₀）-0.56A₄₅₀；
MDA含量(μmol/g)=C×V×10^-3/W.
式中：C——丙二醛的濃度(μmol/L)；V——提取液總體積（mL）；
  W——樣品質量（g）
2.4.4實驗植物大豆植株葉片脯氨酸（Pro）含量的測定^[7][7]
繪制標準曲線：吸取脯氨酸標準母液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL分別放入7支具塞刻度試管，分別加入蒸餾水**2.0mL，其脯氨酸含量分別為0，2.0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0μg.分別吸取上述標準液2mL，加冰醋酸2mL，茚三酮試劑2mL加入試管中，混勻后加玻璃球賽，在沸水浴中加熱15min。用分光光度計于515nm下進行比色測定，以零濃度為空白對照。將測定結果以脯氨酸濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標作標準曲線。
植株樣品液的提取：選取植株功能葉片1.0g，用3mL80%乙醇研磨（放少許石英砂）成勻漿。用2mL80%乙醇洗滌研缽，將提取物和洗液**于試管中，加蓋于黑暗中溫室下提取24h。將提取液在放有活性炭的濾紙上進行過濾，重復過濾一次，記下體積。將濾液置于試管中加其重量1/5的人造沸石強烈震蕩5min。將上層液在離心機上以4000r/min離心10min上清液備用。
   樣品溶液的測定：取2mL上清液置于試管中，再加入2mL冰醋酸和2mL茚三酮試劑，加蓋密封在沸水浴加熱15min。用3mL80%乙醇代替樣品液作為對照。在分光光度計上測510nm處各樣品的吸光度，從標準曲線上求樣品液中脯氨酸含量。
         脯氨酸[μg/g(干或鮮樣)]=（C×V_T/A）/W
（注：C---由標準曲線上查得的脯氨酸的質量（μg）；V#p#分頁標題#e#_T---提取液總體積；A---測定液體積（mL）；W---樣品質量（g）
 
2.4.5實驗植物大豆植株葉片葉綠素質量分數的測定^[8]
稱取大豆0.5g，加入純丙酮5mL，再加入少許碳酸鈣和石英砂于研缽中研磨成勻漿后加入80%丙酮3mL繼續研磨，將研磨液移入10mL離心管中，并用2mL80%丙酮洗滌研缽，后一并導入，以3000r/min離心10min，收集上清液并用80%丙酮定容**20mL。取上清液1mL，加入80%丙酮4mL，以80%丙酮為對照。采用分光光度法, 在波長為645nm、663nm下測定。計算公式如下：
C_a=12.7OD₆₆₃-2.69OD₆₄₅；
C_b=22.9OD₆₄₅-4.68OD₆₆₃；
C_T=C_a+C_b=8.02OD₆₆₃+20.21OD₆₄₅；
葉綠素的含量（mg/g）=[葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數]/樣品鮮重（或干重）。
（注：Ca、Cb、 C_T分別表示葉綠素a、葉綠素b、總的葉綠素，單位為mg/L）計算。
 
2.4.6實驗植物大豆植株葉片超氧化物歧化酶（POD）的測定^[7]
稱取植物材料0.1g，加20mmol/L KH₂PO₄ 0.5mL于研缽中研磨成勻漿后轉入1.5mL的離心管中。用0.5mL20mmol/L KH₂PO₄溶液沖洗研缽后也轉入上述離心管中。12000r/min離心10min，上清液即為粗酶提取液。
取光徑1cm比色杯2只，于一只中加入反應混合液3mL，上述酶20uL（如酶活性過高可適當稀釋）混勻后立即開啟秒表計時，從**分鐘開始于分光光度計470nm波長下讀取OD值，每隔1min讀數一次，連續讀數3分鐘。以每分鐘OD變化值表示酶活性大小，即以△OD470/min·mg蛋白質（或鮮重g）表示。 
2.4.7實驗植物大豆植株葉片相對電導率的測定
稱取用蒸餾水洗凈葉片污物的大豆兩份，每份1.0g,分別放在100mL的編號為A和B的兩個燒杯中，各加入50mL的蒸餾水。A杯常溫處理，B杯稱重后蓋上表面皿，煮沸10-15min,冷卻后再稱重并加蒸餾水**原重量。把兩杯在室溫下放置24h后，用電導率儀測A杯、B杯兩杯的電導率，即用電導率法測定。按下列公式計算：
R（%）=（R₁/R₂）*100
2.4.8實驗植物大豆植株光合效率的測定；
用Handy PEA儀器測定
2.4.9實驗植物大豆植株結瘤率的測定；
 
2.4.10實驗植物大豆植株根系所在沙質培養基pH的測定。
用ph計測定
3 結果與分析
3.1鉛對大豆生長的影響
3.1.1鉛對大豆植株苗長的影響
3.1.2鉛對根冠比的影響
3.1.3 鉛對丙二醛（MDA）含量的影響
3.1.4 鉛對脯氨酸（Pro）含量的影響
3.1.5 鉛對葉綠素含量的影響
3.1.6 鉛對過氧化物酶（POD）的影響
3.1.7 鉛對電導率的影響
3.1.8 鉛對光合效率的影響
3.1.9 鉛對結瘤率的影響
通過硒對鉛脅迫下的豌豆在種子的萌發、植株的生長、根尖細胞分裂及生理代謝等方面的研究表明,低濃度的硒能緩解一定濃度的鉛毒害,增強植物的抗逆境脅迫能力。如當鉛濃度 ≤100 mg/ L時,≤1. 0 mg/ L硒可促進鉛脅迫下豌豆根尖細胞分裂,使種子加速萌發,加快幼苗生長;加入適宜濃度的硒后,硒通過保護葉綠體ATPase活性,提高葉片的葉綠素含量,增強植物的光合作用,從而起到解毒效應。而解毒效應與維持植物體內酶活性平衡密切相關。在鉛濃度≤100 mg/ L時,≤1. 0 mg/ L硒使植物體內使活性氧的清除和生成處于相對的低水平平衡狀態,內環境的穩定,確保了各種生理活動的正常進行,從而表現出防護作用。但抗氧化酶的保護作用是有一定限度的,當硒濃度大于5. 0 mg/ L時,硒則與鉛共同脅迫,致使代謝出現紊亂,各種生命活動受到嚴重抑制。所以,農業生產中可用硒做微肥施用,抑制植物吸收鉛等重金屬,減少它們進入食物鏈,從而降低鉛污染的危害,也可提高植物的含硒量,補充和改善人畜硒營養水平。^[9]
3.2 汞對大豆生長的影響
3.2.1汞對大豆植株苗長的影響
3.2.2汞對根冠比的影響
3.2.3 汞對丙二醛（MDA）含量的影響
3.2.4 汞對脯氨酸（Pro）含量的影響
3.2.5 汞對葉綠素含量的影響
3.2.6 汞對過氧化物酶（POD）的影響
3.2.7 汞對電導率的影響
3.2.8 汞對光合效率的影響
3.2.9 汞對結瘤率的影響
 
3.3 鉛和汞對大豆生長的影響
4 討論
5結論
參考文獻
附錄：
實驗所用主要儀器及相關藥品
1.實驗植物大豆的植株苗長
儀器：直尺
2.實驗植物大豆的根冠比
儀器：剪刀、電子天平
3.實驗植物大豆植株葉片丙二醛含量
儀器：722型分光光度計、比色皿、高速離心機、離心管、電子天平、研缽、恒溫水浴鍋、具刻度試管、剪刀、移液管、移液槍
藥品：三氯乙酸（TCA）、石英砂、硫代巴比妥酸（TBA）
4.實驗植物大豆植株葉片脯氨酸（Pro）含量的測定
儀器：高速離心機、離心管、電子天平、研缽、恒溫水浴鍋、具刻度試管、剪刀、移液管、移液槍、722型分光光度計、恒溫水浴搖床
藥品：冰醋酸、人造沸石、活性炭、磷酸、脯氨酸、無水乙醇、茚三酮
5.實驗植物大豆植株葉片葉綠素質量分數的測定
儀器：高速離心機、離心管、電子天平、研缽、恒溫水浴鍋、具刻度試管、剪刀、移液管、722型分光光度計
藥品：丙酮、碳酸鈣、石英砂 
6.實驗植物大豆植株葉片超氧化物歧化酶（POD）的測定#p#分頁標題#e#
儀器：高速離心機、離心管、電子天平、研缽、具刻度試管、移液管、722型分光光度計、秒表